胰酶消化常见小问题

细胞培养实验中不可或缺的除了培养基,胰酶也是非常重要的一个角色,虽然细胞培养试验基本技术大同小异,每种细胞的培养条件各不相同,但是,在细胞传代过程中都少不了这个步骤—胰酶消化。细胞消化使用胰酶时需要了解哪些问题?

一、 细胞培养过程中为什么要使用胰酶呢?胰酶的作用是什么?
胰酶是一种蛋白酶,酶切位点是肽链的Lys或Arg两个残基的羧基端肽链,通过在特定位置上降解蛋白,使细胞膜上与培养皿壁结合处蛋白降解,从而使两者分离。这时,细胞由于自身内部细胞骨架的张力以及培养液表面张力可成为球形。

二、 使用胎牛血清培养细胞,在使用胰酶消化时发现血清可以终止此过程,这是何原因?

血清终止的原理其实是竞争抑制,就是用过量的牛血清中含有的蛋白和胰酶结合,使胰酶失去消化细胞蛋白的机会。

三、 为什么使用了胰蛋白酶消化,细胞还是成团的,这可能是什么原因导致的?

① 消化时间不够 ② 吹打力度不够 ③ 胰酶消化液浓度不够 ④ 细胞密度过高之后才消化传代 ⑤ 胰酶存储不当,或者使用了过期胰酶

四、 胰酶分装冻存时要注意什么?

胰酶分装时尽量分装成多瓶,并遵守3次左右用完和只装2/3体积的原则。因为冷冻保存时体积会膨胀,多次使用同一瓶胰酶反复冻融会降低消化效果并增大污染的可能性。

五、 怎么才能判断胰酶消化完全?

注意:不是细胞全部成间隔分布很离散的单个圆形才表示消化好了。一般肉眼观察贴壁细胞层,只要能移动了,多半呈沙状移动就可以了,就应该停止消化。

六、 胰酶适用于哪些细胞消化?它的消化效果与哪些有关呢?

胰酶适用于消化细胞间质较少的软组织和传代细胞,如胚胎、上皮、肝、肾等组织,但对纤维性组织和较硬的癌组织效果较差。胰酶的消化效果主要与pH值、温度、胰酶浓度、组织块大小和硬度有关。

七、 胰酶中的酚红有哪些作用?

酚红在培养基中被用来作为pH指示剂,中性时为红色,酸性时为黄色,碱性时为紫色。研究表明:酚红可以模拟固醇类激素(特别是雌激素)的作用。为避免固醇类反应,培养细胞尤其是哺乳类细胞时,建议用不含酚红的培养基。由于酚红干扰检测,在做流式细胞检测时,也会使用不含酚红的培养基或者胰酶。

八、 在做细胞凋亡检测时,细胞为什么不能用含有EDTA的胰酶消化?

Annexin V(膜联蛋白)是Ca2+依赖的蛋白,EDTA会螯合Ca2+从而影响Annexin V,进而影响结果,因此需选用不含EDTA的胰酶。建议放入培养箱中进行消化,时间可以长一点。随时观察细胞情况,避免消化过度;也可使用细胞刮刀将细胞刮下,后用枪吹匀,比消化简单,还可避免使用胰酶带来的伤害。


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