慢病包装FAQ

1. 目前慢病毒包装系统共有三代,不同代次慢病毒包装系统的区别是什么? 

1998年,Miyoshi等通过对HIV基因组的研究揭示出包装慢病毒所需要的最少元件(Miyoshi et. al. J. Virology 72:8150, 1998),称之为第一代慢病毒;在此基础上,第二代慢病毒包装系统将这些元件分别放在不同的表达载体上,同时用疱疹病毒的衣壳蛋白VSVG替代HIV的衣壳蛋白;第三代慢病毒包装系统将慢病毒LTR中的U3区域进行突变修饰,从而制备“self-inactive”的病毒,同时使野生型LTR自身具备的启动子活性丢失,从而防止其表达一些病毒的结构蛋白。

2. 是否存在不适合采用慢病毒进行转染的细胞株?慢病毒的宿主细胞范围是由什么决定的? 

慢病毒感染靶细胞的趋向性是取决于慢病毒的衣壳蛋白与靶细胞细胞膜表面的受体相互作用。VSVG蛋白是应用最为广泛的慢病毒衣壳蛋白,它能够使慢病毒有效的感染广泛的宿主细胞。目前已知的难以用慢病毒进行高效感染的哺乳动物细胞种类有心肌细胞、鼠B细胞等。 更多关于病毒衣壳蛋白的信息,请参考文献Cronin, J., X.-Y. Zhang, et al. (2005). "Altering the tropism of lentiviral vectors through pseudotyping." Current gene therapy 5(4): 387.

3. 重组慢病毒和重组腺病毒的区别是什么?

慢病毒 

腺病毒 

RNA病毒 

DNA病毒 

~9Kb (HIV1) 

~36Kb (AD5) 

整合型病毒 

非整合型 

VSVG衣壳蛋白 

无衣壳蛋白 

表达速度较慢(2-3天) 

表达速度较快(~12h) 

无法扩增,使用293T包装 

可以在HEK293中扩增 

每个细胞仅能被感染几个慢病毒粒子 

多重感染 

滴度较低 

可以制备高滴度病毒 

制备时间短(2-5天) 

制备时间长(3-4周) 

2级(2+)生物安全控制 

2级生物安全控制 

4. 哪些细胞可以用于慢病毒的包装? 

常见的293T、HEK293及293FT均可以应用于慢病毒包装,但HEK293和293FT细胞通常产生较低滴度的慢病毒。5. 慢病毒的滴度受到哪些因素的影响? 

1) 包装细胞的状态及代次:在培养过程中,要尽量避免293T细胞出现汇合度高的情况,处于极高汇合度状态的293T细胞转染效率较低,产生的病毒量少。尽量使用较低代次的293T细胞,连续传代20次后,重新复苏低代次细胞。 

2) 目的基因:慢病毒的滴度随着插入目的基因的长度增加而降低;具有细胞毒性的基因在包装慢病毒时,产生的滴度较低,建议采用诱导表达系统设计项目。 

3) 培养基及血清的影响:培养基的成分及血清的来源对慢病毒的包装滴度影响较大。通常在培养基中添加丙酮酸钠可以提高慢病毒的产量;不同来源的FBS也会导致慢病毒的产量不同,建议在测试不同批号的FBS后,大量储备相同批号的FBS用于慢病毒生产。 

4) 浓缩方法:目前常用的慢病毒浓缩方法有超速离心、PEG8000及柱纯化等方法,超速离心法由于离心力较大,在浓缩过程中可能有部分慢病毒失去感染活力;使用PEG8000浓缩慢病毒由于浓缩倍数较小,不适合大批量慢病毒的生产,柱纯化的方法慢病毒回收效率较低。 

5) 贮存方式:慢病毒对温度变化较为敏感,须避免反复冻融;通常情况下,-80°C贮存半年不会引起明显的滴度下降;在4°C可以储存一周不会引起感染效果的差异。 

6) 滴度测定方法:目前常用的慢病毒滴度测定方案有两种,一种是ELISA法,一种是realtime qPCR法。前者测定的是其物理滴度,而后者测定的是活性滴度。ELISA法测定的滴度通常高于qPCR法得到的滴度。在实际应用过程中,建议采用表达GFP的慢病毒做预实验,以确定最佳的MOI。

6. 操作慢病毒包装系统有特别的生物安全性考虑吗? 

根据NIH的建议,操作慢病毒包装系统主要有两方面的安全性考量。一是可能存在的潜在的慢病毒复制;而是潜在的致瘤性。作为一个外源基因运输工具,慢病毒能够十分高效的进入非分裂的或者处于静息状态的哺乳动物细胞。科研工作者对慢病毒包装系统进行了大量的优化,在提高生物安全性的同时,不损失病毒包装滴度。爱康得所使用的最新一代慢病毒包装系统将病毒衣壳蛋白、包装元件以及目的基因分别置于不同的载体。基因转移载体携带目的基因,同时含有将目的基因整合入靶细胞的序列,在没有衣壳蛋白以及其他包装质粒的情况下,单独应用该载体无法生产出慢病毒颗粒。使用爱康得生产的慢病毒感染靶细胞后,靶细胞不能生产出新的病毒粒子;另外,爱康得的慢病毒包装系统不含有tat基因,同时对3’端LTR的修饰,使其无法转录出全长的完整病毒,进一步提高了生物安全性。更为详尽的慢病毒生物安全性信息,请参照http://oba.od.nih.gov/rdna_rac/rac_guidance_lentivirus.html

 

 


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