1.产品概述

在抗体偶联药物（ADC）研发过程中，候选抗体与靶蛋白结合后的内吞效率，是评价ADC候选抗体的一个关键属性。研究人员通常将候选抗体在4度与37度分别与靶细胞进行孵育，通过FACS评估抗体的内吞效率，即温差法，此方法常出现假阳性的内吞结果；通过pH敏感的溶酶体染料与候选抗体偶联后进行检测的方法，受限于每个候选抗体进行偶联及纯化的繁复实验操作流程，且成本较高。本产品在针对IgG Fc（CH2-CH3）的兔单克隆抗体上偶联了VC-PAB-MMAE分子，作为一款通用二抗偶联物（平均DAR=4），能够与Human IgG1 Fc、Mouse IgG1\IgG2a\IgG2b Fc结合，可以高通量对候选ADC抗体的内吞进行定性及定量检测。

 图 1. Anti-IgG Fc-MMAE检测原理示意图

2. 产品特点

− 代替传统的荧光方案，评价候选抗体介导的靶细胞杀伤，对候选抗体进行排序；

− 结合我们开发的细胞活力检测试剂盒（Cell Viability-Lumi Kit：ICA-CVL-100A）可高通量评价候选候选抗体的内吞效率；

− 检测结果与抗体的内吞效率具有直接相关性，避免假阳性或假阴性结果；

3.产品规格

4.储存条件

-80℃冰箱储存，避免反复冻融。【建议首次开启后，根据需要进行分装】

5. 参考实验流程

1) 材料：

− Anti-Fc-MMAE【首次开启后，分装保存于-80度冰箱中，避免反复冻融】

− Cell Viability-Lumi Kit【首次开启后，分装保存于-80度冰箱中，避免反复冻融】

− 待测靶细胞

− 白边底不透明的96孔或384孔细胞培养板

2) 实验步骤：

(1) 细胞复苏

根据实验需要，从液氮中复苏靶细胞，并连续传代3次，调整至对数生长期。

(2) 细胞处理

−取对数增殖期的靶细胞，用完全培养基重悬为细胞浓度为5×10^4个/mL 。向96孔板四周的孔中加入无菌水100μL/孔，避免连续培养过程中实验孔内液体过度蒸发；向其余孔内先后加入100μL/孔细胞悬液，置于5% CO2、37℃培养箱中培养24h待细胞贴壁（若靶细胞为悬浮细胞，接种后可立即进行药物处理）。

−用完全培养基配置2x Rabbit Anti-Fc-MMAE稀释液(浓度2μg/mL)，此为本次实验的Assay buffer。用Assay buffer与阳性对照抗体或候选抗体等比例混合，配制第一个浓度梯度点（候选抗体浓度10ug/mL），后续用Assay buffer按照3倍梯度稀释，共9个浓度梯度，每个稀释度设置3复孔。

−将上述准备的细胞培养板中的培养基去除，加入上述配置的药物浓度梯度后，将培养板置于培养箱中培养4-5天。另取3个复孔加入100μL 1μg/mL的Rabbit Anti-IgG Fc-MMAE抗体稀释液做对照孔。当无药对照孔细胞汇合度大于80%时进行细胞活率检测。

(3) 检测

从-80度冰箱中取出Cell Viability-Lumi Kit，室温解冻，上下颠倒混匀后，根据待测的孔数，按照100uL/孔，加入到细胞板中，室温避光静置10min。

(4) 读数

将静置10min后的白边底不透明细胞培养板放入Luminometer中进行读数，并进行数据处理。

6.  注意事项

− 二抗本身对靶细胞的非特异性杀伤

在抗体浓度较大的情况，二抗自身可能对靶细胞的增殖产生抑制作用。建议针对不同的靶细胞探索不同浓度的二抗对其增殖活力的影响（一般在3ug/mL以下进行探索）。

− 无菌

药物处理时间较长，需要全程无菌操作，对候选抗体进行无菌过滤。

7. 展示数据